荧光光度计的使用方法

荧光光度计是一种用于测量物质在特定波长光照射下发出的荧光强度和光谱特性的精密分析仪器。为了确保仪器的正常运行和延长其使用寿命，需遵循以下荧光光度计的使用方法：

一、操作前准备

1.仪器与环境检查

仪器状态确认：开机前检查电源、数据线连接是否牢固，样品室门是否关闭（部分仪器需“关门”状态才能启动），检测器、光源（如氙灯）是否处于正常待机状态（氙灯寿命有限，避免频繁开关）。

环境控制：

温度：保持实验室温度稳定（通常20-2℃），避免温度波动导致仪器部件（如光电倍增管）灵敏度变化；

湿度：湿度≤60%，防止光学元件受潮发霉（可配备除湿机）；

避光：关闭样品室附近强光（如直射灯光），避免环境光干扰荧光信号检测；

防震：仪器需放置在稳定台面上，远离离心机、真空泵等震动源，防止光学系统错位。

2.试剂与样品准备

试剂纯度：空白溶剂（如去离子水、乙醇）需“荧光级”或高纯度（如HPLC级），避免杂质自身荧光干扰；标准品需准确称量、配制，浓度梯度覆盖样品预期浓度（通常-7个梯度，确保线性关系）。

样品预处理：

去除杂质：若样品含悬浮物、颗粒物，需通过离心（3000-000rpm，-10min）或0.22μm滤膜过滤，防止堵塞样品池或散射光干扰；

浓度适配：样品浓度过高易导致“荧光猝灭”（信号饱和），需提前稀释至线性范围内（可先做预实验判断浓度范围）；

pH调节：部分物质荧光强度受pH影响显著（如氨基酸、黄酮类），需用缓冲液（如Tris-HCl、磷酸盐缓冲液）调节样品与标准品pH一致。

3.样品池选择与清洁

材质适配：

常用石英样品池（透光性好，紫外-可见区无吸收），避免使用玻璃池（玻璃对紫外光有吸收，会削弱激发光）；

根据样品体积选择规格（如10mm光程、3.mL容量的石英池为常规款），确保样品量覆盖光程（液面需高于进光孔2-3mm）。

清洁流程：

新样品池先用10%硝酸浸泡2-4h，再用去离子水冲洗3-次，烘干备用；

每次使用后，立即用样品溶剂（如乙醇）冲洗3次，再用去离子水冲洗，后用无尘纸吸干外壁水分（避免擦拭内壁，防止划痕）；

若样品残留（如蛋白质、油脂），可用超声清洗仪（20-30℃，-10min）清洗，禁用强腐蚀性试剂（如浓盐酸）。

二、核心操作步骤

以“定量分析”为例，标准操作流程如下（不同品牌仪器界面略有差异，需结合说明书调整）：

1.仪器启动与预热

打开电脑，启动荧光光度计控制软件（如PerkinElmer的FL WinLab、Hitachi的F-7000软件）；

开启仪器主机电源，选择“氙灯”或对应光源（部分仪器需手动点亮光源），预热30min（关键步骤！光源和检测器需稳定后才能检测，否则信号漂移大）；

预热期间，在软件中设置仪器参数（提前规划，减少预热后等待时间）。

2.参数设置：匹配物质荧光特性

参数设置直接影响检测灵敏度和准确性，需根据待测物质的“激发光谱”和“发射光谱”确定核心参数：

参数类别设置要点

激发波长（λex）：先通过“激发光谱扫描”确定：固定发射波长（参考文献或预实验值），扫描激发波长范围（如200-00nm），取荧光强度的波长作为λex（避免干扰峰）。

发射波长（λem）：固定λex，扫描发射波长范围（如300-600nm），取荧光强度的波长作为λem（注意：λem需大于λex，避免激发光散射干扰，即“斯托克斯位移”）。

狭缝宽度激发狭缝、发射狭缝宽度越小，单色性越好，但光强越弱（灵敏度降低）；反之则光强高，但杂散光增多。常规设置：2-10nm（浓度低时选宽狭缝，浓度高时选窄狭缝）。

光电倍增管电压（PMT）：电压越高，灵敏度越高，但背景噪声也会增加。设置原则：空白溶剂的荧光强度≤%满量程（避免过载），通常在400-800V之间（不同仪器范围不同）。

扫描速度：定性扫描（找波长）可慢（如100nm/min），确保峰形清晰；定量检测可快（如300nm/min），提高效率（但需确认速度不影响信号稳定性）。

3.空白校正：消除背景干扰

目的：扣除溶剂、样品池、环境光的背景荧光信号，确保检测信号仅来自待测物质。

操作：将空白溶剂注入石英池（液面至刻度线，避免外壁残留液体），用无尘纸擦拭外壁后，放入样品室的“样品架”中（注意方向：光程面正对光路，不可反放），点击软件“空白校正”或“调零”，待校正完成后取出空白池。

4.标准曲线绘制

按浓度从低到高的顺序，依次将标准品溶液注入样品池，放入样品室，点击“测量”，记录每个浓度对应的荧光强度（F）；

测量完一个标准品后，用下一个标准品溶液润洗样品池2-3次（避免交叉污染），再注入新溶液测量；

全部标准品测量完成后，在软件中以“浓度（C）”为横坐标、“荧光强度（F）”为纵坐标，生成标准曲线，计算线性回归方程（R2需≥0.998，否则需重新配制标准品）。

.样品检测与数据处理

用样品溶液润洗样品池2-3次，注入样品溶液，放入样品室，点击“测量”，记录样品的荧光强度（F样）；

若样品需稀释，需记录稀释倍数（n），将F样代入标准曲线方程，计算样品的“稀释后浓度”，再乘以n得到“样品原始浓度”；

每个样品建议平行测量3次，取平均值（相对标准偏差RSD需≤%，确保重复性）。

6.实验结束后操作

关闭光源（如氙灯），等待仪器冷却10-1min后，关闭主机电源和电脑；

立即清洗样品池（按“操作前准备”中的清洁流程），晾干后收纳；

清理样品台，记录仪器使用日志（包括使用时间、样品类型、光源状态、异常情况等）；

关闭实验室电源、空调、灯光，确保环境安全。

总结：以上是荧光光度计的使用方法，遵循以上方法，可确保数据的准确性，从而延长其仪器寿命。